Camilla Kappe Ph.D.
Från inkretiner och inkretinbehandling vid diabetes till molekylär reglering av tillväxt, viabilitet och funktion av GLP-1-producerande celler
– En introduktion till inkretiner och sammanfattning av avhandling inom typ 2 diabetes: ”Molecular regulation of growth, viability and function of GLP-1-producing cells”
Inkretiner
För drygt 100 år sedan gjordes upptäckten att vävnadsextrakt från tarmen kunde reducera glukosuri hos diabetespatienter, genom vad som antogs vara stimulerad hormonutsöndring från pankreas (46). De aktiva substanser som låg till grund för denna glukossänkande effekt identifierades sedermera och benämndes ”inkretin” (INtestine seCRETtion Insulin).
På 1960-talet konstaterades att dessa inkretiner låg bakom det förstärkta insulinsvar som ses om glukos ges oralt, jämfört med i.v. glukos-infusion resulterande i samma blodsockernivå. Det skulle dock ta dryga 50 år från det att benämningen inkretin togs i bruk till att de två hormon som fungerar som inkretin — gastrisk inhiberande peptid (GIP) och glukagon-liknande peptid 1 (GLP-1) — identifierats.
GIP- och GLP-1-inducerade effekter medieras av bindning till — och aktivering av — GIP-receptorn (GIPR) samt GLP-1-receptorn (GLP-1R), vilka båda är G-proteinkopplade. Dessa receptorer uttrycks i perifer vävnad (exempelvis på betaceller i pankreas), men också i CNS, och GLP-1/GIP-inducerade effekter härrör delvis från direkt aktivering av dessa receptorer på målvävnad, men också till följd av centralnervös reglering. Inkretinbindning till receptorerna ökar intracellulärt cAMP och aktiverar proteinkinas A (PKA) samt ”exchange protein activated by cAMP” (EPAC), vilka medierar en lång rad intracellulära mekanismer som bidrar till ökad glukosberoende insulinfrisättning (31, 37, 60, 72).
Som inkretiner har dessa hormoner således en blodsockersänkande effekt genom potent stimulering av insulinfrisättning fån pankreas (3, 23), en effekt med stor fysiologisk relevans då den står för 40-60% av insulinfrisättningen efter måltid hos friska. Djurexperimentella studier har också påvisat ytterligare effekter på betacellerna i pankreas, där bildning av nya betaceller stimuleras medan apoptos (programmerad celldöd) hämmas. Sammantaget leder detta till ett ökat antal betaceller.
Vid T2D är frisättningen av glukagon från alfacellerna i pankreasöarna ökad. Frisättningen av glukagon hämmas normalt av höga glukosnivåer, men vid T2D är denna effekt av glukos nedsatt, vilket leder till ökade glukagonnivåer och därmed ökad glukosfrisättningen från levern som bidrar till högt blodsocker (hyperglykemi). GLP-1 hämmar glukagonfrisättning och även väldigt låga fastenivåer av GLP-1 kontrollerar blodsockernivån genom att hämma glukagonfrisättning – en effekt som dock är tydligt glukosberoende och upphör vid fasteblodsocker under normal nivå (68). Till följd av GIP-signalering ses inte denna hämning av glukagonfrisättning, utan i motsats ses en ökad glukagonfrisättning som svar på GIP (73).
Utöver effekterna på endokrina pankreas, har båda dessa peptidhormon direkta effekter på centrala nervsystemet och bidrar till ökad kognitiv förmåga. GLP-1 inducerar även mättnadskänsla genom reglering av leptin-signalering. Centralnervösa mekanismer bidrar också till den ökade insulinfrisättningen till svar på GLP(5, 49)
Ett annat spännande område där GLP-1 verkar ha direkta, positiva effekter är endoteldysfunktion och makroangiopatiska diabeteskomplikationer. En separat artikel om just detta kommer i ett senare nummer av Vaskulär Medicin av en annan doktorand i Åke Sjöholms diabetesgrupp.
Både GIP och GLP-1 har vidare också direkta effekter på magtarmkanalen där GIP hämmar sekretion av magsyra, medan GLP-1 signalering leder till långsammare tömning av magsäcken. Den ökade mättnadskänslan och långsammare tömningen av magsäcken som ses som svar på GLP-1 bidrar till dess blodsockersänkande effekt och ligger till grund för de viktreducerande effekter som ses med ökad GLP-1 signalering och därmed klassificeringen av GLP-1 som ”anorexigenic”. Viktnedgång som svar på GLP-1 ligger exempelvis troligen bakom dess effekter på insulinsignalering, där GLP-1 visats motverka insulinresistens och öka insulinkänsligheten (35). GIP, som vid sidan av effekterna ovan också bidrar till uppbyggnad av fettdepåer, associeras inte med viktnedgång utan anses vara ”obesogenic” (15, 17, 73).
Inkretinernas effekter på insulin-frisättning gör dem attraktiva som behandlingar vid T2D. Emellertid har ökad glukagonfrisättning och adipogena effekter som svar på GIP avlett intresset för behandling med GIP vid T2D. Samtidigt ses också ett defekt svar på GIP, så kallad GIP-resistens vid T2D. En generell defekt i GLP-1-signalering kan dock inte konstateras – vilket skapar förutsättningarna för GLP-1-baserad behandling vid T2D (50). Vidare har studier påvisat ökad frisättning av GIP vid T2D, medan nedsatt GLP-1-frisättning indikerats (41-42, 69-70) och väckt frågeställningar kring rollen för GLP-1 i diabetisk patogenes.
T2D, obesitas och GLP-1
Obesitas (BMI > 30) ökar risken för insulinresistens och T2D (10), som karaktäriseras av inte bara högt blodsocker (hyperglykemi) utan också förhöjda cirkulerande nivåer av fria fettsyror (hyperlipidemi), associerat med försämrad insulinfrisättning och försämrat glukosupptag i perifer vävnad.
Defekt inkretinsvar och nedsatt GLP-1-frisättning har inte bara visats vid insulinresistens (53) och T2D (41-42, 69), men också vid förhöjt BMI (63) och obesitas oberoende av T2D (48). Emellertid indikeras normal GLP-1-frisättning vid T2D i andra studier och en generell defekt kan inte konstateras (2). Det förefaller troligt att skillnaderna beror på olikheter mellan de patientgrupper som utgjort underlaget för studierna, där en viktig skillnad skulle kunna vara olika sjukdomsstadier. I studier på patientgrupper med högre HbA1c, har nedsatt GLP-1-frisättning påvisats (63), medan studier på patientgrupper med lägre HbA1c och relativt bättre glykemisk kontroll inte påvisat nedsatt GLP-1-frisättning (70).
Användningen av olika belastningar, d.v.s. skillnader mellan måltidssammansättning eller glukosbelastning, samt graden av insulinresistens kan också bidra till att nedsatt GLP-1-frisättning inte kunnat konstateras i alla patientgrupper. Vidare är troligen patientgruppens användning av olika farmaka, och när inför en studie sådan behandling avslutas, en avgörande faktor – effekterna av eventuell blodsockersänkande farmaka kan dröja kvar och maskera eventuellt nedsatt GLP-1-frisättning. I enlighet med detta visar studier där blodsockersänkande behandling tagits bort tidigare (3 dagar innan studiens början) nedsatt GLP-1-frisättning (63), medan studier där behandling tagits bort först 2 dagar innan indikerar normal GLP-1-frisättning (57, 70).
Sammanfattningsvis kan konstateras att fler studier behövs för att fastställa hur GLP-1-frisättningen ser ut vid T2D. Tydligt är dock att infusion av GLP-1 kan normalisera både fastande och prandiellt blodglukos hos patienter med T2D (30).
GLP-1-behandling vid T2D
Användningen av GLP-1 som läkemedel försvåras av snabb nedbrytning med en halveringstid på 2 minuter (29), där > 80 % av aktivt GLP-1 har degraderats vid passage genom levern. Den snabba nedbrytningen av GLP-1 katalyseras av enzymet dipeptidyl peptidas-4 (DPP-4) i plasma och medför att peptiden blir inaktiv.
DPP-4 är ett peptidas-enzym som existerar både bundet till plasmamembranet på många celltyper och i en löslig cirkulerande form. Peptider med aminosyran prolin eller alanin (som GLP-1) på position 2 räknat från den N-terminala änden kan klyvas av DPP-4 vilket leder till att de två N-terminala aminosyrorna spjälkas bort.
För att kunna använda GLP-1 som läkemedel vid T2D har stabila GLP-1-analoger framställts. Dessa DPP-4-resistenta analoger har en halveringstid som är hanterbar i en klinisk situation.
Exendin-4 är ett exempel på en sådan stabil GLP-1-analog med en cirka 50-procentig strukturlikhet med GLP-1. Exendin-4 tillverkas som en rekombinant peptid under namnet exenatid. Exenatid har en halveringstid på 60-90 min och administreras subkutant 2 gånger per dag. Långtidsverkande exendin-4 (Bydureon) har också nyligen tagits fram för behandling 1 gång/vecka.
En annan stabil GLP-1 analog är liraglutid (Victoza), där en aminosyra i GLP-1 bytts ut, och GLP-1 försetts med en fettsyra. Fettsyran gör att substansen blir albuminbunden med en halveringstid på 10-14 timmar och liraglutid kan således ges subkutant 1 gång per dag.
Ytterligare ett tillvägagångssätt som framtagits för GLP-1-baserad behandling av T2D är DPP-4-hämmare – för att förlänga halveringstiden av endogent frisatt GLP-1. Dessa DPP-4-hämmare ges oralt och ett exempel är sitagliptin (Januvia). Nyligen har visats att sitagliptin oberoende av DPP-4 också har direkta effekter på GLP-1 producerande celler, där cAMP aktivering och extracellulärt reglerat kinas (ERK1/2) signalering ökar frisättningen av GLP-1 (58). Andra DPP-4-hämmare är vildagliptin (Galvus), saxagliptin (Onglyza), alogliptin (Nesina) och linagliptin (Trajenta).
Dessa GLP-1-baserade behandlingar har visat sig framgångsrika för sänkning av blodglukos. Efter 26 veckor reducerar liraglutid HbA1c med 1.1 % (12 mmol/mol) jämfört med en reducering på 0.8 % (9 mmol/mol) som svar på behandling med exenatid (11). Viktnedgången till följd av behandling med exenatid eller liraglutid är dock jämförbar (11). Efter behandling med DPP-4-hämmare ses en, i jämförelse med stabila GLP-1-analoger, något mindre effekt på HbA1c och ingen viktnedgång (4).
En fördel med GLP-1-basered terapi är att hypoglykemi är extremt sällsynt som biverkan, då effekterna av GLP-1 är glukosberoende. Däremot är illamående initialt en vanlig biverkan vid behandling med stabila GLP-1 analoger, medan DPP-4 hämmare inte har denna biverkan.
Vidare kan viss oro vara befogad för användningen av DPP-4-hämmare, eftersom DPP-4 inaktiverar ett stort antal peptider, såsom GLP-2, IGF-1, substans P och flera cytokiner (34). Även pankreatit har sporadiskt rapporterats som möjlig biverkan av GLP-1-analoger och DPP-4-hämmare, även om kunskapsläget kring ev orsakssamband ännu får anses bristfälligt.
Nyligen har dock alarmerande biverkningar av GLP-1-baserade behandlingar rapporterats i ett arbete, med tydlig tillväxt av exokrina och endokrina pankreas, där ökad proliferation och ett ökat antal alfaceller observeras i endokrina delar (12). Dessa data indikerar möjlig risk för bildning av endokrina tumörer i pankreas till följd av långvarig behandling med dagens GLP-1-baserade terapi. Även om denna enskilda rapport baserades på ensiffriga observationer från grupper som inte var helt matchade, utreds frågan av regulatoriska läkemedelsmyndigheter.
Det kan tänkas att de biverkningar som ses med dagens inkretinbehandlingar kommer av de höga statiska nivåer av aktivt GLP-1/GLP-1 analog som åstadkoms, där höga nivåer av aktivt GLP-1 även når perifera organ som exempelvis pankreas. Detta är ett ofysiologiskt fenomen då endogen GLP-1 frisättning har ett pulsatilt mönster (6) och frisätts direkt till leverns portåder (vena porta) där centralnervösa mekanismer för bl.a. blodsockerreglering stimuleras. Samtidigt ses till följd av endogen GLP-1-frisättning aldrig de höga nivåer av aktivt GLP-1 — som existerar i portalt blod — i perifera organ som exempelvis pankreas (16). Det bör också noteras att GLP-1R internaliseras till följd av ligandbindning (67), och ett pulsatilt frisättningsmönster skulle kunna syfta till att förhindra GLP-1-resistens (45).
Att öka/återställa den endogena GLP-1-frisättningen vid T2D är således ett mer fysiologiskt alternativ som erbjuder många fördelar framför dagens GLP-1-baserade terapi och utgör ett framtida mål för utvecklingen av bättre och säkrare behandling av T2D.
Man kan tänka sig olika strategier för att uppnå detta, däribland direkta effekter på hormonfrisättning alternativt att en ökad massa av de enteroendokrina L-celler som producerar GLP-1 uppnås genom till exempel ökad viabilitet (52). För att farmakologiskt åstadkomma ökad endogen frisättning av GLP-1 — via ökad L-cellsfunktion/viabilitet — behövs emellertid mer kunskap om de mekanismer som reglerar GLP-1-producerande celler under friska och diabetiska förhållanden.
L-cellen och GLP-1-sekretion
GLP-1 är en peptid med 30 aminosyror, där hälften av aminosyrasekvensen är identisk med den för glukagon, varav namnet glukagonlik peptid.
GLP-1 är — i likhet med glukagon — en produkt av proglukagon och frisätts från L-celler i tarmens epitel till blodbanan i samband med måltid. Proglukagon uttrycks således både i tarmens L-celler och i pankreasöarnas alfaceller, men processas olika tack vare vävnadsspecifikt uttryck av prokonvertas (PC). PC1 och PC3 uttrycks i L-cellerna i tarmen, medan PC2 uttrycks i alfacellerna. Under inverkan av dessa prokonvertas spjälkas proglukagon således till olika slutprodukter, vilket resulterar i GLP-1 i tarmens L-celler, och glukagon i alfacellerna. Nivåerna av GLP-1 i plasma ökar inom 10–15 min efter måltid och når toppkoncentrationer på 15–50 pmol/l efter ca 40 min (28) hos friska individer.
De flesta GLP-1-producerande L-celler är lokaliserade till de mer distala delarna av tarmen, d.v.s. ileum och colon. Om det finns tillräckligt med L-celler proximalt i tarmen för att ett GLP-1 svar redan efter 10 min ska kunna ske till följd av näringsstimulering är fortfarande debatterat. Dock står det klart att det vid sidan av näringsstimulerad frisättning av GLP-1 förekommer neuronal och hormonell reglering. Som stöd för den fysiologiska relevansen av sådan indirekt reglering av GLP-1-frisättningen efter måltid finns djurstudier som visar att frisättning av näringskänsliga molekyler i tarmens mer proximala delar reglerar frisättning av GLP-1 från de mer distala L-cellerna via mekanismer som involverar vagusnerven (56).
Tarmkanalens mucosa och epitel veckar sig för att bilda finger-liknande utskott som kallas villi, vilka ökar ytan ut mot tarmlumen. Längs hela tarmkanalen i epitelet finns specialiserade celler, inklusive specialiserade endokrina celler såsom GLP-1-producerande L-celler och GIP-producerande K-celler. Detta epitel genomgår konstant förnyelse, där L-celler — med ursprung i progenitorceller i de kryptor som bildas mellan villi — differentierar till mogna L-celler medan de migrerar uppför villi, för att sedan efter en tid lossna och försvinna ut i tarmlumen. (13, 55). Positionerad på villi har L-cellen apikala mikrovilli mot tarmlumen och hormon-vesiklar lokaliserade till det basolaterala membranet som också har kontakt med blodkärl och nervbanor. Denna morfologi tillåter både hormonell och neuronal reglering samt direkt stimulering av näringsämnen i lumen (21, 65).
Förenklad illustration av L-cellens unika miljö, Apikala mikrovilli mot tarmlumen och ett basolateralt membran i kontakt med blodkärl och nervbanor tillåter både hormonell och neuronal reglering, samt direkt stimulering av näringsämnen i lumen
GLP-1-frisättning stimuleras av fett, socker och protein, via depolarisering av plasmamembranet, öppnandet av spänningsberoende kalciumkanaler och ökade nivåer av intracellulärt kalcium nödvändligt för frisättning av GLP-1. Notabelt är att oralt glukos/fett stimulerar GLP-1 utsöndring medan hyperglykemi/hyperlipidemi inte inducerar GLP-1-frisättning (38, 62).
L-cellens glukosavkänning är komplex och involverar flera olika mekanismer som samverkar för att definiera glukossvaret (65). L-cellen uttrycker ATP-beroende kaliumkanaler och glukokinas (24, 51, 54), men glukosstimulerad GLP-1-frisättning från modeller av L-cellen uppvisar ett EC50 (0.2–0.5 mmol/l) som skiljer sig avsevärt från det för glukokinas (S0.5 ∼ 8 mmol/l) (44), vilket indikerar inblandningen av ytterligare mekanismer. Troligt är att natrium–glukos cotransportörer (SGLT) utgör en viktig del av de mekanismer som styr glukossvaret (47). SGLTs använder en inåtriktad natriumgradient för att mediera glukosupptag även vid låga koncentrationer av glukos. I cellkulturer har man kunnat visa att SGLT-aktivitet är tillräckligt för depolarisering av plasma-membranet och GLP-1-frisättning.
De mekanismer som styr L-cellens protein-svar är i stort okända. Inte heller de mekanismer som styr L-cellens svar på fettsyror är fullständigt identifierade, men G-proteinkopplade receptorer — GPR40, GPR119 och GPR120 — har visats vara involverade (1, 27, 64) (1, 26). Vidare har uncoupling protein 2 (UCP2), som reglerar produktionen av fria radikaler, indikerats i fettsyra-stimulerad GLP-1-frisättning (14), medan dess uttryck har direkt motsatt effekt på glukos-stimulerad GLP-1-frisättning (74).
Emellertid har få, om ens några, studier tittat på hur L-cellerna påverkas mer långsiktigt till följd av T2D och hyperlipidemi.
Lipotoxicitet
Ett kardinalfynd vid T2D är höga nivåer av fria fettsyror (59). I provröret kan man simulera denna hyperlipidemi genom att under lång tid exponera celler för fria fettsyror, och många sådana studier har visats inducera celldöd i till exempel insulinproducerande celler (71).
Fria fettsyror tas upp av celler i huvudsak av fettsyratransportörer som CD36/FAT (20, 61). Fettsyror kan också diffundera genom plasmamembranet (eller fungera som ligander för G-proteinkopplade receptorer). Väl inne i cellen kan fettsyrorna esterifieras, generera lipidderiverade molekyler såsom DAG och ceramider, eller tas upp av mitokondrien för betaoxidation. Aktivering av AMP-beroende protein kinas (AMPK) har en avgörande roll för initieringen av betaoxidation genom att fosforylera och hämma enzymet acetyl-CoA carboxylas (ACC). ACC katalyserar karboxylering av acetyl-CoA vilket ger malonyl-CoA, som i sin tur fungerar som ett substrat för fettsyrasyntes och en potent hämmare av mitokondriellt fettsyraupptag (40). Ackumulering av triglycerider i andra vävnader än fettvävnad är en indikation på att lipidnivåerna är för höga och associeras med defekt insulinsignalering och lipotoxicitet (25). Dock är det troligt att ackumulering av triglycerider och triglyceriderna i sig inte ligger till grund för denna lipotoxicitet (39, 66). Bland troliga patologiska processer bakom lipotoxicitet kan istället tänkas generering av lipidderiverade molekyler som t.ex. ceramider, vilka kan leda till apoptos. Vidare kan mitokondriens kapacitet för fettförbränning överskridas vid hyperlipidemi, vilket leder till ökad produktion av reaktiva syreföreningar (ROS, ”Reactive oxygen species”). En del reaktiva syreföreningar ingår i funktioner i cellen som till exempel signalering, men då i mycket små mängder. Större mängder av ROS i kroppen — till följd av metabol stress (såsom hyperlipidemi) — kan orsaka allvarliga skador på viktiga biologiska molekyler som DNA och RNA, och resulterar bl.a. i apoptos.
Effekterna av hyperlipidemi är dock komplexa, och av vikt för inducerad effekt är lipidernas kedjelängd och mättnad liksom tidsförloppet (8, 39-40). Till exempel kan nämnas att akut exponering för fria fettsyror har visats stimulera insulinfrisättning samt även GLP-1-frisättning i både cellkulturer och djurmodeller (7, 33, 64)
Effekterna av långvarig behandling med olika antidiabetiska läkemedel på GLP-1-producerande celler är i stort också okända. Dock finns indikationer på att den endogena frisättningen av GLP-1 kan påverkas:
Metformin är i dag förstahandsmedel till patienter med typ 2-diabetes. Bland metforminets effekter ses minskad hepatisk glukosproduktion, ökad insulinkänslighet, förbättrad glykemi och glukostolerans. Flera studier har påvisat ökade plasmanivåer av GLP-1 efter långtidsbehandling med metformin hos obesa patienter med eller utan typ 2-diabetes (43), men de bakomliggande mekanismerna är i princip okända. Vidare har kronisk behandling med exendin-4 och DPP-4-hämmare indikerats reducera endogen GLP-1-frisättning (19).
Syftet med avhandlingen (fulltext på: http://publications.ki.se/xmlui/handle/10616/41313), var att studera effekter av simulerad diabetisk hyperlipidemi och anti-diabetiska läkemedel på funktion och viabilitet av GLP-1-producerande celler med hjälp av cellkulturer och djurmodeller. Detta med målsättningen att genom identifiering av potentiella effekter kunna hitta mekanismer och intracellulära mål för modulering av endogen GLP-1-frisättning.
Sammanfattning av avhandling
För studier på cellkulturer användes GLUTag-celler genomgående som en modell för GLP-1-producerande L-celler. Då L-celler utgör mindre än 10 % av de celltyper som återfinns i primära cellkulturer från tarm, är GLUTag en väl använd modell. GLUTag är en permanent odödlig cellinje, bestående av enteroendokrina celler från mus som uttrycker proglukagon-genen och utsöndrar GLP-1 (36). GLUTag-celler uttrycker en repertoar av receptorer, jonkanaler och glukos-sensorer, samt uppvisar ett svar på fysiologiska och farmakologiska sekretagoger som är väl överensstämmande med det svar som ses hos den primära murina L-cellen (9, 18),(54). Vidare överensstämmer de signaleringsvägar som är aktiva i GLUTag-celler väl med de i primära murina L-celler, där GLUTag-celler och primära L-celler också uppvisar ett glukos-svar med liknande EC50 (54).
Genomförda studier visar att hyperlipidemi, simulerad genom exponering av odlade GLUTag-celler för höga nivåer av den mättade fettsyran palmitat under 48 timmar, inducerade apoptos av dessa celler (33).
Simulerad hyperlipidemi inducerar programmerad celldöd (apoptos) av GLP-1-producerande celler. Efter 48h ses — från vänster till höger — reducerad viabilitet, ökad aktivitet av proteaset caspase-3, samt ökad fragmentering av DNA (från referens 32).
Till följd av simulerad hyperlipidemi ses även en tydligt ökad produktion av ROS. En fatal roll för de ökade nivåerna av ROS indikeras också då samtidig behandling med antioxidanten Trolox uppvisar en skyddande effekt och hämmar proteaser inblandade i apoptos. I likhet med observationer från liknande studier på insulinproducerande celler sågs en ökad aktivering av ROS-känsliga mitogen-aktiverade proteinkinaser (MAPK): c-Jun N-terminalt kinas (MKK4 – JNK) och MKK3/6 – p38 till svar på simulerad hyperlipidemi. Vidare visar våra resultat att dessa kinaser medierar den lipotoxiska effekten, då farmakologisk inhibering av JNK och p38 reducerar lipotoxicitet genom att hämma inblandade proteaser (32-33).
Inducerad apoptos till följd av simulerad hyperlipidemi involverar ökad produktion av reaktiva syreföreningar (ROS), samt medieras av mitogen-aktiverade proteinkinaser. Produktion av ROS är signifikant ökad efter 24 h i närvaro av palmitat (Ö.V.), medan samtida behandling (48 h) med antioxidanten Trolox reducerar aktivering av proteaset caspase-3 involverat i apoptos (Ö.H.). Farmakologisk inhibering av JNK (N.V.) och p38 (N.H.) hämmar aktivering av caspase-3 till svar på simulerad hyperlipidemi (från referens 31).
Våra studier har även visat att metforminbehandling — trots ökad produktion av ROS — förhindrar aktivering/uttryck av JNK och p38 och lipoapoptos, vilket skulle kunna tolkas som en ökad mitokondriell oxidativ kapacitet. I likhet med metforminets effekter i andra vävnadstyper förefaller denna skyddande effekt vara medierad av substratet AMP-beroende kinas (AMPK), då den lipoprotektiva effekten kunde reduceras genom farmakologisk inhibering av AMPK (33).
Vidare ser vi en ökad frisättning av GLP-1 i närvaro av metformin, en effekt som ses efter en kronisk behandling med metformin, men som – vilket ett flertal andra studier också visar – är obefintlig efter akut exponering. Troligt är att metformin sensitiserar dessa GLP-1-producerande celler för sekretagoger i inkubationsmedium
Andra resultat inkluderade i avhandlingen innefattar indikationer på lipoprotektiva effekter, samt ökad GLP-1 frisättning, som svar på exendin-4 och insulin – vilket indikerar en roll för parakrin/autokrin reglering av både L-cellens funktion och viabilitet. Dock är utförliga mekanistiska studier nödvändliga för att klarlägga vad som ligger bakom de observerade effekterna.
Sammanfattande illustration av i avhandlingen identifierad reglering av GLP-1 producerande celler. ROS; Reaktiva syreföreningar, p38; p38 mitogen-aktiverat protein kinas, JNK; c-Jun N-terminalt kinas, AMPK; 5′ adenosine monofosfat-aktiverat protein kinas, PKA; protein kinas A, cAMP; cykliskt adenosine monofosfat, GLP-1R; GLP-1 receptorn, IR; Insulin receptorn
För att utvärdera den fysiologiska relevansen av de observerade effekterna genomfördes en djurstudie där möss fick högfettsdiet under 10 veckor. Indikationerna på ett reducerat antal GLP-1-positiva celler i tarmvävnad föranleder ytterligare studier på hur L-cellen påverkas av diabetisk hyperlipidemi.
Det kan tänkas att en högfettsdiet initialt leder till stimulering av GLP-1-frisättning som svar på enterala fettsyror, men att sedermera inducerad hyperlipidemi och lipotoxiska effekter reducerar antalet L-celler och leder till ett defekt GLP-1-svar då kompensationsförmågan hos kvarvarande L-celler överskrids. Det kan tänkas att L-cellsmassa och GLP-1-frisättning återhämtas då den initiala ökningen av blodfetter till följd av högfettsdiet med tiden regleras och eventuell sänkning av blodfetter erhålls (22). Dock torde nedsatt GLP-1-frisättning vid metabola komplikationer som hyperlipidemi ha negativa effekter på insulinproducerande betaceller, något som tillsammans med andra metabola effekter av nedsatt GLP-1-signalering sannolikt bidrar till en ökad risk för utvecklingen av insulinberoende T2D.
De lipotoxiska effekter som indikeras i dessa studier till följ av exponering för höga nivåer av fria fettsyror under en längre tid är ett helt nytt fenomen, och skulle kunna ge en förklaring till hur en diabetisk miljö med tiden kan leda till ett defekt GLP-1 svar och därigenom förklara den brist på GLP-1 hos patienter med T2D eller obesitas som rapporterats i flera studier (se ovan). Dessa data indikerar också direkta positiva effekter av antidiabetiska läkemedel på viabilitet och funktion hos GLP-1-producerande celler. Mot bakgrund av dessa studier skulle man t.ex. kunna tänka sig att de ökade GLP-1-plasmanivåer som ses vid långtidsbehandling med metformin är ett resultat av ökad GLP-1-frisättning, både genom effekter på hormonfrisättningen per se och genom ökad viabilitet och ett ökat antal L-celler vid diabetisk hyperlipidemi.
En stor del av dagens diabetesvård fokuserar fortfarande f.f.a. på förbättrad glykemisk kontroll. Bekräftelse av dessa resultat också i cellernas naturliga miljö, skulle vara av betydelse för valet av behandlingsstrategi vid T2D, då det ytterligare förstärker vikten av diagnostisering och behandling av hyperlipidemi även i de fall då ökad kardiovaskulär risk inte föreligger.
Samtidigt kan dess studier i förlängningen, genom identifiering av de mekanismer som ligger till grund för observerade effekter, leda till identifiering av potentiella intracellulära mål för modulering av endogen GLP-1-frisättning.
Referenser
1. Ahren B. The future of incretin-based therapy: novel avenues–novel targets. Diabetes Obes Metab 13 Suppl 1: 158-166, 2011.
2. Ahren B, Carr RD, and Deacon CF. Incretin hormone secretion over the day. Vitam Horm 84: 203-220, 2010.
3. Ahren B, Holst JJ, and Mari A. Characterization of GLP-1 effects on beta-cell function after meal ingestion in humans. Diabetes Care 26: 2860-2864, 2003.
4. Amori RE, Lau J, and Pittas AG. Efficacy and safety of incretin therapy in type 2 diabetes: systematic review and meta-analysis. JAMA 298: 194-206, 2007.
5. Balkan B, and Li X. Portal GLP-1 administration in rats augments the insulin response to glucose via neuronal mechanisms. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 279: R1449-1454, 2000.
6. Balks HJ, Holst JJ, von zur Muhlen A, and Brabant G. Rapid oscillations in plasma glucagon-like peptide-1 (GLP-1) in humans: cholinergic control of GLP-1 secretion via muscarinic receptors. J Clin Endocrinol Metab 82: 786-790, 1997.
7. Beglinger S, Drewe J, Schirra J, Goke B, D’Amato M, and Beglinger C. Role of fat hydrolysis in regulating glucagon-like Peptide-1 secretion. J Clin Endocrinol Metab 95: 879-886, 2010.
8. Bell RM, and Coleman RA. Enzymes of glycerolipid synthesis in eukaryotes. Annu Rev Biochem 49: 459-487, 1980.
9. Brubaker PL, Schloos J, and Drucker DJ. Regulation of glucagon-like peptide-1 synthesis and secretion in the GLUTag enteroendocrine cell line. Endocrinology 139: 4108-4114, 1998.
10. Burke JP, Williams K, Gaskill SP, Hazuda HP, Haffner SM, and Stern MP. Rapid rise in the incidence of type 2 diabetes from 1987 to 1996: results from the San Antonio Heart Study. Arch Intern Med 159: 1450-1456, 1999.
11. Buse JB, Rosenstock J, Sesti G, Schmidt WE, Montanya E, Brett JH, Zychma M, and Blonde L. Liraglutide once a day versus exenatide twice a day for type 2 diabetes: a 26-week randomised, parallel-group, multinational, open-label trial (LEAD-6). Lancet 374: 39-47, 2009.
12. Butler AE, Campbell-Thompson M, Gurlo T, Dawson DW, Atkinson M, and Butler PC. Marked Expansion of Exocrine and Endocrine Pancreas with Incretin Therapy in Humans with increased Exocrine Pancreas Dysplasia and the potential for Glucagon-producing Neuroendocrine Tumors. Diabetes 2013.
13. Chandrasekaran C, Coopersmith CM, and Gordon JI. Use of normal and transgenic mice to examine the relationship between terminal differentiation of intestinal epithelial cells and accumulation of their cell cycle regulators. J Biol Chem 271: 28414-28421, 1996.
14. Chen Y, Li ZY, Yang Y, and Zhang HJ. Uncoupling protein 2 regulates glucagon-like peptide-1 secretion in L-cells. World J Gastroenterol 18: 3451-3457, 2012.
15. Cho YM, and Kieffer TJ. K-cells and glucose-dependent insulinotropic polypeptide in health and disease. Vitam Horm 84: 111-150, 2010.
16. D’Alessio D, Lu W, Sun W, Zheng S, Yang Q, Seeley R, Woods SC, and Tso P. Fasting and postprandial concentrations of GLP-1 in intestinal lymph and portal plasma: evidence for selective release of GLP-1 in the lymph system. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 293: R2163-2169, 2007.
17. Diakogiannaki E, Gribble FM, and Reimann F. Nutrient detection by incretin hormone secreting cells. Physiol Behav 106: 387-393, 2012.
18. Drucker DJ, Jin T, Asa SL, Young TA, and Brubaker PL. Activation of proglucagon gene transcription by protein kinase-A in a novel mouse enteroendocrine cell line. Mol Endocrinol 8: 1646-1655, 1994.
19. El-Ouaghlidi A, Rehring E, Holst JJ, Schweizer A, Foley J, Holmes D, and Nauck MA. The dipeptidyl peptidase 4 inhibitor vildagliptin does not accentuate glibenclamide-induced hypoglycemia but reduces glucose-induced glucagon-like peptide 1 and gastric inhibitory polypeptide secretion. J Clin Endocrinol Metab 92: 4165-4171, 2007.
20. Glatz JF, Luiken JJ, and Bonen A. Membrane fatty acid transporters as regulators of lipid metabolism: implications for metabolic disease. Physiol Rev 90: 367-417, 2010.
21. Gribble FM, Williams L, Simpson AK, and Reimann F. A novel glucose-sensing mechanism contributing to glucagon-like peptide-1 secretion from the GLUTag cell line. Diabetes 52: 1147-1154, 2003.
22. Guldbrand H, Dizdar B, Bunjaku B, Lindstrom T, Bachrach-Lindstrom M, Fredrikson M, Ostgren CJ, and Nystrom FH. In type 2 diabetes, randomisation to advice to follow a low-carbohydrate diet transiently improves glycaemic control compared with advice to follow a low-fat diet producing a similar weight loss. Diabetologia 55: 2118-2127, 2012.
23. Gutniak MK, Larsson H, Heiber SJ, Juneskans OT, Holst JJ, and Ahren B. Potential therapeutic levels of glucagon-like peptide I achieved in humans by a buccal tablet. Diabetes Care 19: 843-848, 1996.
24. Habib AM RF, Parker HE and Gribble FM. Expression of glucose-sensing machinery in intestinal GLP-1 secreting cells. Diabetologia 50: S287, 2007.
25. Hagberg CE, Mehlem A, Falkevall A, Muhl L, Fam BC, Ortsater H, Scotney P, Nyqvist D, Samen E, Lu L, Stone-Elander S, Proietto J, Andrikopoulos S, Sjoholm A, Nash A, and Eriksson U. Targeting VEGF-B as a novel treatment for insulin resistance and type 2 diabetes. Nature 490: 426-430, 2012.
26. Hansen HS, Rosenkilde MM, Holst JJ, and Schwartz TW. GPR119 as a fat sensor. Trends Pharmacol Sci 33: 374-381, 2012.
27. Hirasawa A, Tsumaya K, Awaji T, Katsuma S, Adachi T, Yamada M, Sugimoto Y, Miyazaki S, and Tsujimoto G. Free fatty acids regulate gut incretin glucagon-like peptide-1 secretion through GPR120. Nat Med 11: 90-94, 2005.
28. Holst JJ. The physiology of glucagon-like peptide 1. Physiol Rev 87: 1409-1439, 2007.
29. Holst JJ, and Deacon CF. Inhibition of the activity of dipeptidyl-peptidase IV as a treatment for type 2 diabetes. Diabetes 47: 1663-1670, 1998.
30. Holst JJ, and Gromada J. Role of incretin hormones in the regulation of insulin secretion in diabetic and nondiabetic humans. Am J Physiol Endocrinol Metab 287: E199-206, 2004.
31. Kang G, Chepurny OG, Malester B, Rindler MJ, Rehmann H, Bos JL, Schwede F, Coetzee WA, and Holz GG. cAMP sensor Epac as a determinant of ATP-sensitive potassium channel activity in human pancreatic beta cells and rat INS-1 cells. J Physiol 573: 595-609, 2006.
32. Kappe C, Holst JJ, Zhang Q, and Sjoholm A. Molecular mechanisms of lipoapoptosis and metformin protection in GLP-1 secreting cells. Biochem Biophys Res Commun 427: 91-95, 2012.
33. Kappe C, Patrone C, Holst JJ, Zhang Q, and Sjoholm A. Metformin protects against lipoapoptosis and enhances GLP-1 secretion from GLP-1-producing cells. J Gastroenterol 2012.
34. Kirby M, Yu DM, O’Connor S, and Gorrell MD. Inhibitor selectivity in the clinical application of dipeptidyl peptidase-4 inhibition. Clin Sci (Lond) 118: 31-41, 2010.
35. Koliaki C, and Doupis J. Incretin-based therapy: a powerful and promising weapon in the treatment of type 2 diabetes mellitus. Diabetes Ther 2: 101-121, 2011.
36. Lee YC, Asa SL, and Drucker DJ. Glucagon gene 5′-flanking sequences direct expression of simian virus 40 large T antigen to the intestine, producing carcinoma of the large bowel in transgenic mice. J Biol Chem 267: 10705-10708, 1992.
37. Light PE, Manning Fox JE, Riedel MJ, and Wheeler MB. Glucagon-like peptide-1 inhibits pancreatic ATP-sensitive potassium channels via a protein kinase A- and ADP-dependent mechanism. Mol Endocrinol 16: 2135-2144, 2002.
38. Lindgren O, Carr RD, Deacon CF, Holst JJ, Pacini G, Mari A, and Ahren B. Incretin hormone and insulin responses to oral versus intravenous lipid administration in humans. J Clin Endocrinol Metab 96: 2519-2524, 2011.
39. Listenberger LL, Han X, Lewis SE, Cases S, Farese RV, Jr., Ory DS, and Schaffer JE. Triglyceride accumulation protects against fatty acid-induced lipotoxicity. Proc Natl Acad Sci U S A 100: 3077-3082, 2003.
40. Lopaschuk GD, Ussher JR, Folmes CD, Jaswal JS, and Stanley WC. Myocardial fatty acid metabolism in health and disease. Physiol Rev 90: 207-258, 2010.
41. Lugari R, Dei Cas A, Ugolotti D, Finardi L, Barilli AL, Ognibene C, Luciani A, Zandomeneghi R, and Gnudi A. Evidence for early impairment of glucagon-like peptide 1-induced insulin secretion in human type 2 (non insulin-dependent) diabetes. Horm Metab Res 34: 150-154, 2002.
42. Mannucci E, Ognibene A, Cremasco F, Bardini G, Mencucci A, Pierazzuoli E, Ciani S, Fanelli A, Messeri G, and Rotella CM. Glucagon-like peptide (GLP)-1 and leptin concentrations in obese patients with Type 2 diabetes mellitus. Diabet Med 17: 713-719, 2000.
43. Mannucci E, Ognibene A, Cremasco F, Bardini G, Mencucci A, Pierazzuoli E, Ciani S, Messeri G, and Rotella CM. Effect of metformin on glucagon-like peptide 1 (GLP-1) and leptin levels in obese nondiabetic subjects. Diabetes Care 24: 489-494, 2001.
44. Matschinsky FM. Regulation of pancreatic beta-cell glucokinase: from basics to therapeutics. Diabetes 51 Suppl 3: S394-404, 2002.
45. Meier JJ. GLP-1 receptor agonists for individualized treatment of type 2 diabetes mellitus. Nat Rev Endocrinol 2012.
46. Moore B. On the treatment of Diabetus mellitus by acid extract of Duodenal Mucous Membrane. Biochem J 1: 28-38, 1906.
47. Moriya R, Shirakura T, Ito J, Mashiko S, and Seo T. Activation of sodium-glucose cotransporter 1 ameliorates hyperglycemia by mediating incretin secretion in mice. Am J Physiol Endocrinol Metab 297: E1358-1365, 2009.
48. Muscelli E, Mari A, Casolaro A, Camastra S, Seghieri G, Gastaldelli A, Holst JJ, and Ferrannini E. Separate impact of obesity and glucose tolerance on the incretin effect in normal subjects and type 2 diabetic patients. Diabetes 57: 1340-1348, 2008.
49. Nakabayashi H, Nishizawa M, Nakagawa A, Takeda R, and Niijima A. Vagal hepatopancreatic reflex effect evoked by intraportal appearance of tGLP-1. Am J Physiol 271: E808-813, 1996.
50. Nauck MA, Heimesaat MM, Orskov C, Holst JJ, Ebert R, and Creutzfeldt W. Preserved incretin activity of glucagon-like peptide 1 [7-36 amide] but not of synthetic human gastric inhibitory polypeptide in patients with type-2 diabetes mellitus. J Clin Invest 91: 301-307, 1993.
51. Nielsen LB, Ploug KB, Swift P, Orskov C, Jansen-Olesen I, Chiarelli F, Holst JJ, Hougaard P, Porksen S, Holl R, de Beaufort C, Gammeltoft S, Rorsman P, Mortensen HB, and Hansen L. Co-localisation of the Kir6.2/SUR1 channel complex with glucagon-like peptide-1 and glucose-dependent insulinotrophic polypeptide expression in human ileal cells and implications for glycaemic control in new onset type 1 diabetes. Eur J Endocrinol 156: 663-671, 2007.
52. Pedersen J, Ugleholdt RK, Jorgensen SM, Windelov JA, Grunddal KV, Schwartz TW, Fuchtbauer EM, Poulsen SS, Holst PJ, and Holst JJ. Glucose-metabolism is altered after loss of L- and alpha-cells, but not influenced by loss of K-cells. Am J Physiol Endocrinol Metab 2012.
53. Rask E, Olsson T, Soderberg S, Johnson O, Seckl J, Holst JJ, and Ahren B. Impaired incretin response after a mixed meal is associated with insulin resistance in nondiabetic men. Diabetes Care 24: 1640-1645, 2001.
54. Reimann F, Habib AM, Tolhurst G, Parker HE, Rogers GJ, and Gribble FM. Glucose Sensing in L Cells: A Primary Cell Study. Cell Metab 8: 532-539, 2008.
55. Rindi G, Ratineau C, Ronco A, Candusso ME, Tsai M, and Leiter AB. Targeted ablation of secretin-producing cells in transgenic mice reveals a common differentiation pathway with multiple enteroendocrine cell lineages in the small intestine. Development 126: 4149-4156, 1999.
56. Rocca AS, and Brubaker PL. Role of the vagus nerve in mediating proximal nutrient-induced glucagon-like peptide-1 secretion. Endocrinology 140: 1687-1694, 1999.
57. Ryskjaer J, Deacon CF, Carr RD, Krarup T, Madsbad S, Holst J, and Vilsboll T. Plasma dipeptidyl peptidase-IV activity in patients with type-2 diabetes mellitus correlates positively with HbAlc levels, but is not acutely affected by food intake. Eur J Endocrinol 155: 485-493, 2006.
58. Sangle GV, Lauffer LM, Grieco A, Trivedi S, Iakoubov R, and Brubaker PL. Novel biological action of the dipeptidylpeptidase-IV inhibitor, sitagliptin, as a glucagon-like peptide-1 secretagogue. Endocrinology 153: 564-573, 2012.
59. Sheehan MT, and Jensen MD. Metabolic complications of obesity. Pathophysiologic considerations. Med Clin North Am 84: 363-385, vi, 2000.
60. Shibasaki T, Sunaga Y, and Seino S. Integration of ATP, cAMP, and Ca2+ signals in insulin granule exocytosis. Diabetes 53 Suppl 3: S59-62, 2004.
61. Su X, and Abumrad NA. Cellular fatty acid uptake: a pathway under construction. Trends Endocrinol Metab 20: 72-77, 2009.
62. Thomsen C, Rasmussen O, Lousen T, Holst JJ, Fenselau S, Schrezenmeir J, and Hermansen K. Differential effects of saturated and monounsaturated fatty acids on postprandial lipemia and incretin responses in healthy subjects. Am J Clin Nutr 69: 1135-1143, 1999.
63. Toft-Nielsen MB, Damholt MB, Madsbad S, Hilsted LM, Hughes TE, Michelsen BK, and Holst JJ. Determinants of the impaired secretion of glucagon-like peptide-1 in type 2 diabetic patients. J Clin Endocrinol Metab 86: 3717-3723, 2001.
64. Tolhurst G, Heffron H, Lam YS, Parker HE, Habib AM, Diakogiannaki E, Cameron J, Grosse J, Reimann F, and Gribble FM. Short-chain fatty acids stimulate glucagon-like peptide-1 secretion via the G-protein-coupled receptor FFAR2. Diabetes 61: 364-371, 2012.
65. Tolhurst G, Reimann F, and Gribble FM. Nutritional regulation of glucagon-like peptide-1 secretion. J Physiol 587: 27-32, 2009.
66. Unger RH. Lipotoxicity in the pathogenesis of obesity-dependent NIDDM. Genetic and clinical implications. Diabetes 44: 863-870, 1995.
67. Widmann C, Dolci W, and Thorens B. Agonist-induced internalization and recycling of the glucagon-like peptide-1 receptor in transfected fibroblasts and in insulinomas. Biochem J 310 ( Pt 1): 203-214, 1995.
68. Vilsboll T, Holst JJ. Incretins, insulin secretion and Type 2 diabetes mellitus. Diabetologia 47: 357-366, 2004.
69. Vilsboll T, Krarup T, Deacon CF, Madsbad S, and Holst JJ. Reduced postprandial concentrations of intact biologically active glucagon-like peptide 1 in type 2 diabetic patients. Diabetes 50: 609-613, 2001.
70. Vollmer K, Holst JJ, Baller B, Ellrichmann M, Nauck MA, Schmidt WE, and Meier JJ. Predictors of incretin concentrations in subjects with normal, impaired, and diabetic glucose tolerance. Diabetes 57: 678-687, 2008.
71. Wu P, Yang L, and Shen X. The relationship between GPR40 and lipotoxicity of the pancreatic beta-cells as well as the effect of pioglitazone. Biochem Biophys Res Commun 403: 36-39, 2010.
72. Yabe D, and Seino Y. Two incretin hormones GLP-1 and GIP: comparison of their actions in insulin secretion and beta cell preservation. Prog Biophys Mol Biol 107: 248-256, 2011.
73. Yutaka Seino MF, Daisuke Yabe. GIP and GLP-1, the two incretin hormones: Similarities and differences. Journal of Diabetes Investigation 1: 8-23, 2010.
74. Zhang H, Li J, Liang X, Luo Y, Zen K, and Zhang CY. Uncoupling protein 2 negatively regulates glucose-induced glucagon-like peptide 1 secretion. J Mol Endocrinol 48: 151-158, 2012.
Camilla Kappe Ph.D.
Sammanfattning av sin avhandling
För DiabetologNytt, publicerat också i Vaskulär Medicin nr 2 2013